带有胍基侧链的精氨酸，作为蛋白质中一种关键的基本氨基酸，在酶催化、大分子相互作用、能量代谢及免疫调节等生命过程中都发挥着不可替代的重要作用。然而，相较于半胱氨酸、赖氨酸等其它亲核氨基酸，精氨酸的化学反应性较低，难以实现对其高选择性的共价标记。尽管已有一些化学探针被开发用于精氨酸标记，但其在复杂的蛋白质组环境中进行全局性、定量分析的能力仍然有限，这导致在系统研究精氨酸在蛋白质发挥功能中的作用时面临着巨大挑战。

北京大学化学与分子工程学院，北大-清华生命联合中心雷晓光教授领衔的科研团队长期致力于开发新一代高效的生物相容反应，通过化学探针或化学交联剂结合质谱技术研究蛋白质的功能及结构（JACS 2013, 135, 4996; Elife 2016, 5, e12509; Anal. Chem. 2018, 90, 1195; Nat. Commun. 2019, 10, 3911; Nat. Commun. 2022, 13, 1468）。

近日，该研究团队在《德国应用化学》（Angew. Chem. Int. Ed.）杂志上在线发表了题为：“Quantitative Reactivity Profiling of Functional Arginine Residues in Human Cancer Cell Line Proteomes”的研究论文（图1），首次开发了一种基于特定精氨酸标记探针的化学蛋白质组分析方法，成功绘制了人类癌细胞中精氨酸反应性的全景图谱。该研究不仅介绍了一种可以大规模对蛋白质组中精氨酸残基进行反应性分析的方法，还揭示了多个此前未报道的功能性精氨酸位点，为癌症靶向治疗提供了全新思路。

（图1）论文截图

在这项研究中，作者使用带有苯基乙二醛的化学探针，结合同位素标签串联正交酶切的ABPP技术（isoTOP-ABPP），成功将该技术的应用范围扩展至功能性精氨酸的系统性全局分析，在四个肿瘤细胞系中实现了对近17,000个精氨酸的反应性定量分析。为进一步验证分析结果，团队开展了酶活测定、哺乳动物细胞双杂交、等温量热滴定等一系列实验，最终确认了一批在酶催化和大分子相互作用中，参与功能调控的重要功能性精氨酸（图2）。

（图2）通过isoTOP-ABPP方法定量精氨酸反应性并识别功能性精氨酸

研究团队使用带有炔基的苯基乙二醛探针AP-1，在四种人类癌细胞系（MDA-MB-231、HepG2、Caco-2、HeLa）中系统性地分析了精氨酸的反应性，获得了涵盖大量蛋白质位点的定量数据集。通过比较不同浓度探针标记后的同位素比例（R值）来确定氨基酸反应性的高低。通过酶活测定、哺乳动物细胞双杂交和等温量热滴定等验证手段，团队从识别出的高反应活性氨基酸中成功鉴定出多个对酶的催化活性、蛋白-蛋白相互作用、蛋白-核酸相互作用具有重要贡献的精氨酸残基。在这些氨基酸上进行单点突变即可削弱酶的催化活性或大分子间的相互作用。这其中，乳酸脱氢酶LDHA的R171、LDHB的R172、丙酮酸激酶PKM的R43、肌酸激酶CKB的R341、真核起始因子EIF4A1的R168以及远上游元件结合蛋白FUBP1的R118是新识别出的功能精氨酸位点，此前未被报道。研究团队针对CKB的R341进行了更为深入的细胞生物学探索，发现CKB的R341突变可通过抑制CKB活性阻碍肌酸与磷酸肌酸之间的转化，显著抑制肿瘤细胞的增殖与迁移能力。这些结果共同证明了这项研究开发的isoTOP-ABPP蛋白质组学方法在精确识别功能性精氨酸残基方面的强大能力与可行性。基于对LDHA上高反应性精氨酸位点的深入理解，研究团队进一步设计并合成了靶向LDHA的共价抑制剂ArGO-LDHA-1，该分子表现出对LDHA的强效、不可逆抑制（图3），为开发针对精氨酸的共价抑制剂设计提供了新思路。

（图3）共价抑制剂ArGO-LDHA-1对LDHA具有强效、持久、不可逆的抑制活性

总体而言，这项研究通过对四种癌细胞系进行蛋白质组学分析，成功筛选出390个含有高反应性精氨酸的蛋白质，系统阐释了功能性精氨酸在多种蛋白发挥功能中起到的调控机制，极大深化了对其在肿瘤发生中多功能角色的理解，填补了亲核氨基酸化学蛋白质组学研究中的空白。这项工作不仅高效全面绘制出肿瘤细胞蛋白质组范围内的精氨酸反应性图谱，深化了对精氨酸功能多样性的理解，更精准鉴定出可靶向的功能性精氨酸位点，有力推动了针对此前被视为“不可成药”蛋白质的共价抑制剂研发，在基础研究与临床转化领域均具有重要科学意义和广阔应用前景。