供诊断检测用黄嘌呤氧化酶（XOD）制备技术

诊断检测用重组黄嘌呤氧化酶（XOD）的制备技术

技术背景：

黄嘌呤氧化酶（Xanthine oxidase, XOD）在医疗诊断领域具有广泛和深度的应用，主要用于嘌呤类化合物的检测，同时也可以应用于测定5’-核苷磷酸化酶的活性，适用于肝胆肿瘤检测。同时还广泛应用于血清无机磷的水平(高磷血症)和超氧化物歧化酶SOD活力的检测。XOD是诊断检测行业非常重要的一个酶种，目前XOD的售价在￥170/kU以上，远远高于其他诊断检测用酶的价格。

由于XOD的基础研究成果的匮乏，导致此酶可以进行规模制备的生物来源非常少。传统的XOD主要从牛奶中提取，来源单一，成本非常高，且受奶源质量影响较大。同时，由于基因结构以及翻译后加工的复杂性，XOD在大肠杆菌的表达尝试遇到了极大的困难。目前商业化的XOD大多数来源于诱导表达的红球菌和假单胞菌，这些方法或存在生产菌生长较慢，或者存在表达诱导剂非常昂贵的缺点。因此，XOD制备方法的换代更新，具有迫切性，经济而且高效的制备方法，具有广阔的市场价值。

技术概况：

为了解决XOD制备来源匮乏及生产效率低下的问题，本发明针对目前现有技术的不足，提供一种临床诊断检测用黄嘌呤氧化酶的制备技术。该方法将黄嘌呤氧化酶基因导入P. putida 菌株内表达，进行高密度发酵的同时无需诱导剂即可表达XOD基因。表达后，进一步利用金属镍亲和层析，一步纯化后即可浓缩、干燥。

此方法具有细胞生长周期短、细胞密度大、表达量高、纯化工艺简单、纯化得率高、生产成本低等优势。

生产技术主要参数：

菌株：P. putida

质粒：自主知识产权质粒，无需诱导剂诱导

培养技术：常规微生物培养，高密度发酵细胞OD可达60左右

单位活力：高密度发酵细胞活力可达10U/ml

纯化技术：常规镍亲和柱纯化，纯化后进行浓缩

产品性状及参数：

形态色泽：褐色干粉

电泳结果：和TOYOBO生产的同类产品相似（图1）

图1本技术制备的XOD和TOYOBO产品对比

注：1. 本技术生产的产品；2. TOYOBO产品

比活力：>10U/mg蛋白

稳定性：-20℃约12个月

分子量：电泳约120 kDa，分子筛约160 kDa

Km值：6× 10-5 M（黄嘌呤）

最适温度及pH值：40℃，pH 8.0

pH稳定性：25℃，pH8.0，24小时活力损失10%

热稳定性：55℃，pH8.0，30分钟活力损失50%

知识产权：

核心技术未申请专利，可协议转让。

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