化学反应通常以单分子形式进行描述，却极少在单分子水平上被监测和表征，目前对化学反应的分析大多是基于体系内总体平均的结果，然而，平均效应会掩盖单分子行为造成一些重要信息的丢失。极少先进的单分子分析仪器可以报告单分子不同方面的特性，生物纳米孔算是其中最具“性价比”的技术，它适合研究水相环境中的化学反应，提供较高的分辨率。然而，由于解析单分子化学的纳米孔反应器构建十分困难，这种酷炫的技术遇到了技术瓶颈。因此，亟需一种技术突破，可以实现任何类型，数量或空间组合的反应位点，完全自由地放置在纳米孔道内任何位置上，以此实现最大自由度地构建纳米孔单分子反应器。

近日，南京大学化学化工学院黄硕教授课题组报道了一种可编程纳米孔单分子反应器技术（Programmable Nano-Reactors for Stochastic Sensing, PNRSS, /p’na:s/），并借此方法快速构建了5种纳米孔单分子反应器，报告了20个单分子化学反应。该技术巧妙地将功能化反应位点设计在DNA链上，DNA链在纳米孔中电场力作用下充分拉伸，并利用亲和素阻挡，防止穿过孔道，DNA链上暴露的反应位点，可以与自由转移的分析物结合，汇报信号。这条DNA链被定义为PNRSS链，由功能模块组成，在反应区域的反应位点可以进行任意功能化修饰，并且该位点与纳米孔识别区域的相对位置可以通过延伸区域进行微调，以满足不同的分析需求，实现最大限度可编程性。

天然的核酸碱基，如鸟嘌呤、腺嘌呤或它们的任何组合，可以作为配体与金属离子结合。在PNRSS技术的第一个演示实验中，以双鸟嘌呤作为配体，协同结合Ni²⁺离子，汇报出信号（图1）。通过对这一现象进行理论模拟，发现N(7)和O(6)原子在Ni²⁺配位中起关键作用。 

图1.PNRSS技术的概念演示

除了天然碱基，更多人工合成的修饰碱基单体，为PNRSS链的设计和合成提供了极大的自由，彻底拓宽了PNRSS技术的应用。在后续的实验中，PNRSS链上合成引入一个包含炔基的胸腺嘧啶衍生物，通过点击反应修饰含有各种功能化基团的叠氮基衍生物，进一步阐述PNRSS技术。

去甲肾上腺素、肾上腺素和异丙肾上腺素是三种儿茶酚胺衍生物，在生命体内具有不同的功能。这些功能上的差异是由于它们化学结构的细微变化造成的。通过在PNRSS链上修饰苯硼酸基团，三种儿茶酚胺衍生物在PNRSS测量中汇报出丰富的化学反应信息，结合机器学习算法，实现混合样品中传感事件的自动识别，准确率高达98.0%（图2）。 

图2. PNRSS技术同时传感和鉴定去甲肾上腺素，肾上腺素和异丙肾上腺素

瑞德西韦是一种抗病毒药物，作用是阻断RNA依赖的聚合酶，阻止病毒进一步复制，在细胞中代谢转化为其活性的三磷酸形式。使用PNRSS技术，可以在限域空间中确定瑞德西韦及其代谢物与苯硼酸的单分子结合动力学，并实现了二者的直接鉴别。以上演示扩大了PNRSS技术可研究的反应物类型，可能会启发药物动力学或药物筛选的应用（图3）。 

图3.PNRSS技术传感核苷类似物抗病毒药物瑞德西韦及其三磷酸代谢产物

此前报道的纳米孔单分子化学的研究大多局限于可逆反应，因为任何发生在纳米孔腔内反应位点的不可逆反应都将终止新的化学信息的产生。然而，在PNRSS技术中，含有反应位点的PNRSS链可以通过电压与孔道分离或是重新加载，可以重复监测一个不可逆的单分子反应，这是PNRSS技术的独特性（图4）。

图4. PNRSS技术对不可逆化学反应的反复测量

PNRSS技术的出现打破了纳米孔单分子化学研究中构建纳米反应器的技术瓶颈，可以将任何数量或类型的活性基团引入纳米孔腔的任何点。有了PNRSS技术，原本针对纳米孔进行的蛋白质工程改造，已经转化为合成功能性的DNA，这是无数生物化学实验室或公司提供的一项低成本服务，大大降低了纳米孔单分子化学研究工作的门槛。

该工作以“Programmable nano-reactors for stochastic sensing”为题，于2021年10月4日发表于《Nature Communications》（文章链接：https://www.nature.com/articles/s41467-021-26054-9，DOI: 10.1038/s41467-021-26054-9）。我院博士生贾文东为该论文第一作者，我院黄硕教授为论文通讯作者，陈洪渊院士对该工作做出了重要指导。我院马晶教授，博士生顾玉明在理论计算方面提供了大力帮助。此项研究得到了生命分析化学国家重点实验室以及南京大学化学和生物医药创新研究院（ChemBIC）的重要支持。国家自然科学基金（项目编号：31972917，91753108，21675083）、江苏省高层次创业创新人才引进计划（个人、团体计划）、江苏省自然科学基金（项目编号：BK20200009）、南京大学卓越计划（项目编号：ZYJH004）、上海市市级科技重大专项、南京大学生命科学分析化学国家重点实验室（项目编号：5431ZZXM1902）、南京大学科技创新基金资助项目等经费支持。

参考资料：https://chem.nju.edu.cn/43/e7/c12639a541671/page.htm