酰胺键和酯键是自然界最基本和最重要的官能团，它们还广泛存在于药物、功能材料、化妆品等精细化学品及其它合成中间体中，因此，酰胺键和酯键的构建受到了科学家的广泛关注。特别是酰胺键，它的形成不但是药物合成化学中应用最广泛的有机反应，而且是多肽与蛋白质合成过程中的根本化学反应（酰胺键反复形成的过程）。虽然化学家发展了很多酰胺键形成方法，但应用最广泛的方法仍然是缩合剂介导的酸胺缩合反应。然而，传统缩合剂面临着反应条件苛刻、副产物难分离、会诱发过敏反应等问题。特别是用于α-手性羧酸的缩合时经常会导致α-手性中心的外消旋化。不但降低了目标产物的收率，而且增加了产物纯化的难度。为了抑制消旋的发生，还需要使用化学计量的消旋抑制剂，导致反应体系更加复杂，提高了副反应发生的风险，产生更多的化学废物。化学家尝试把促进缩合和抑制消旋两种功能整合到一个分子中开发了一系列双功能缩合剂。然而这些双功能缩合剂的结构一般都比较复杂，分子量大，对空气中的水气敏感，副反应多，副产物难分离。虽然已有上百种商业化的缩合试剂，但化学从业者经常对一些看似简单的酸胺（醇）缩合反应依然束手无策。因此，发展高效、简单的不消旋缩合剂仍然是化学家亟待解决的重要科学问题。
广州医科大学赵军锋教授团队致力于化学与生命科学前沿交叉领域的研究，拟通过发展有机化学新反应和新试剂来解决多肽与蛋白质化学合成与精准修饰领域中的关键科学问题。2016年，他们首次发现炔酰胺可用作不消旋的多肽缩合剂（J. Am. Chem. Soc., 2016, 138, 13135）。该类缩合试剂结构简单、分子量小（最简单的炔酰胺缩合剂分子量只有133）、稳定性好；反应可以在室温、敞口容器中进行，操作简单、方便；无需任何添加剂和催化剂，极大地体现了其原子经济性的优势。更重要的是含有α-手性中心的羧酸在缩合过程中不会发生消旋，从而提高了目标产物的纯度和收率，降低了产物纯化的难度。因此，其不但可用于普通酰胺的合成，还可用于多肽合成和更容易发生消旋的多肽片段连接（图1）。多肽合成经过一百多年的发展，已经达到了一个很高的水平，且通过固相多肽合成仪已实现了自动化。因此，多肽合成经常被大家误认为是已经发展的非常成熟的领域，但其实不然，多肽合成仍然还有很多棘手的问题，特别是肽键形成过程中的消旋副反应一直困扰着该领域的从业者。多肽合成是通过缩合剂介导的若干α-手性氨基酸之间的反复酸胺缩合来实现的，肽键消旋造成的多肽差向异构体与目标多肽的理化性质非常相近，纯化极其困难，不但导致收率降低，同时还增加了生产成本。炔酰胺缩合剂能够不消旋的构建肽键，将有望解决传统多肽缩合剂面临的消旋问题，为多肽合成提供新的解决方案。下载化学加APP，阅读更有效率。
他们还将炔酰胺缩合剂用于更具挑战性的硫代多肽的合成。将多肽主链骨架上普通酰胺键中的氧原子用硫原子替代而得到的硫代酰胺键（硫肽键）是一种重要的化学生物学工具，但硫肽键构建时更容易发生外消旋化（差向异构化）副反应。目前仅有一种方法可实现硫代多肽的合成，且有很大的局限性，因此硫代多肽合成上的困难严重制约了硫肽键在蛋白质化学生物学领域的广泛应用。赵军锋课题组充分利用炔酰胺缩合剂不消旋的优点，创建了一种炔酰胺介导的以单硫代羧酸为原料的硫代酰胺键形成方法，并成功将其用于硫代多肽的合成（图2）。该方法除了能在液相多肽合成中模块化式的引入硫代酰胺，还可在固相多肽合成中精准引入硫代酰胺，实现了多肽主链骨架的精准硫代酰胺键修饰。由于该方法操作简单、反应条件温和，解决了多肽与蛋白质硫代酰胺键修饰在化学生物学研究应用中的瓶颈问题，将极大地促进硫代酰胺键在化学生物学中的广泛应用（Angew. Chem. Int. Ed., 2019, 58, 1382，J. Org. Chem., 2020, 85, 1484.）。
为了拓展炔酰胺类缩合剂的应用范围，他们进一步将炔酰胺缩合剂用于酯键的构建。在碱催化剂的辅助下，炔酰胺缩合剂可以高效促成羧酸与醇或酚的分子间缩合反应（J. Org. Chem. 2020, 85, 6188）。值得注意的是α-手性羧酸的分子间酯化也能够高效地进行，且其手性中心在反应过程中不会发生外消旋化。众说周知，大环内酯化反应一直是天然产物和药物合成化学家所面临的一个极具挑战性的难题。虽然化学家发展了一些大环内酯化方法，但是α-手性羟基羧酸的外消旋化以及α,β-不饱和羟基羧酸的碳碳双键顺/反异构化问题一直是大环内酯化反应悬而未决的问题。在分子间酯化反应的基础上，他们经过深入探索，成功实现了炔酰胺介导的大环内酯化（分子内酯化）反应。化学加，加你更精彩。虽然分子间酯化反应的碱催化条件并不凑效，但是炔酰胺介导的分子内酯化反应可在酸催化剂的作用下顺利进行（ACS Catal. 2020, 10, 5230.）。他们发现炔酰胺介导的大环内酯化反应可以很好的避免α-手性羟基羧酸的消旋以及α,β-不饱和羟基羧酸碳碳双键的顺/反异构化的发生。不像传统的大环内酯化方法需要在无水、高温、强碱性和极低浓度（1 mM）的条件下进行，炔酰胺缩合剂介导的大环内酯化反应不但可在室温敞口容器中顺利进行，而且在5-10 mM反应物浓度条件下即可有效避免分子间酯化竞争反应的发生，这一特点使得在规模化制备大环内酯时能够节省大量溶剂（图3）。
最近，赵军锋教授团队在不消旋缩合剂开发领域又取得了新的进展。基于炔酰胺缩合剂的成功基础之上，他们提出了从同样含有sp杂化碳原子的联烯衍生物中开发缩合剂的想法并最终发现了联烯酮缩合试剂（图4，J. Am. Chem. Soc.2021, 143, 10374-10381）。联烯酮与炔酰胺的作用机制类似，都是通过与羧酸的加成反应生成烯基活化酯，然后再与胺发生氨解反应。与炔酰胺缩合剂相比，联烯酮缩合剂生成活化酯的速度较慢，但其烯基活化酯的氨解活性很高，反应在几分钟内即可完毕。那些位阻大的酰胺以及用炔酰胺缩合剂不能制备的低亲核性芳胺的酰胺也都能顺利获得。对于困难底物，10%的HOBt催化剂能够显著提升反应速度。同时，联烯酮在活化α-手性羧酸时也能够很好的避免消旋，因此也可用于肽键的形成。20种天然氨基酸均可作为氨基组分和羧基组分来构建肽键，大位阻非天然氨基酸也可兼容，显示了该方法的广谱性。除了简单的二肽之外，更加容易消旋的多肽片段连接也可不消旋的高效进行，为长链多肽的液相合成提供了极佳的解决方案。图4. 联烯酮介导的不消旋酰胺键形成在多肽合成中的应用值得注意的是联烯酮缩合剂与氨基酸形成的烯基活化酯大多都是稳定的固体，且其氨解反应非常迅速，大部分都可在1个小时内反应完毕。由于联烯酮与氨基酸形成的烯基活化酯的活性高，因此其可用于固相多肽合成。与传统固相多肽合成每步缩合需要氨基酸、缩合剂、消旋抑制剂和碱性添加剂等四种试剂相比，该方法只需要活化酯这一种试剂即可（10%的HOBt可显著缩短反应时间），极大地简化了固相多肽合成的试剂配方，展现出了显著的优越性。利用联烯酮与氨基酸制备出的活化酯为合成砌块，他们以98%的粗产物纯度实现了经典困难十肽ACP(65-74)的固相合成（图5），效果远远优于传统缩合方法。此外，氨基酸烯基活化酯在DMF溶剂中在室温下可保存十天而不变质，因此该方法还可用于多肽的自动合成。图5. 烯基酯在困难多肽ACP(65-74)的固相合成中的应用
总结：广州医科大学赵军锋教授团队聚焦化学与生命科学前沿交叉研究领域，在多肽化学合成与精准修饰上取得了原创性、系统性的研究成果。提出了以烯基活化酯为稳定中间体的缩合试剂设计概念，发现了炔酰胺与联烯酮两款原创型多肽缩合试剂，解决了多肽合成过程中α-氨基酸手性中心消旋的问题，创建了多肽主链骨架上精准硫代酰胺键修饰方法。炔酰胺和联烯酮两类缩合试剂是当前结构最简单的不消旋缩合试剂，它们分子量小（最小的炔酰胺和联烯酮缩合剂分子量分别为133和144），单独使用即可避免α-手性羧酸的消旋。它们的反应条件温和，都可在室温、敞口容器中高效进行，操作简单、方便，副反应少。这两类新型缩合剂都是以稳定的烯基活化酯为关键中间体，即可通过“两步一锅法”进行，也可分开两步进行，具有高度的灵活性。由于烯基活化酯的制备无需外加羟基亲核试剂和消旋抑制剂，且其活性比传统活化酯活性高、氨解速度快，克服了传统活化酯难合成与活性低的不足。因此，炔酰胺与联烯酮类缩合剂兼具了传统缩合剂和活化酯的优点，而又避免了二者的缺点，是迄今为止结构最简单的不消旋缩合剂。炔酰胺和联烯酮两类原创型缩合剂的开发为酰胺、酯、大环内酯、环内酰胺、多肽、环肽、硫代多肽等重要物质的合成提供了新的方法，具有重要的实际应用价值和广阔的工业应用前景。同时，以烯基活化酯为稳定中间体的缩合剂设计理念为缩合试剂的设计开辟了新的方向，具有重要的科学意义。我们相信，随着将来更深入和系统的研究，这两类新型缩合试剂有望为多肽的规模化绿色合成带来变革性解决方案。赵军锋教授团队网页链接：https://www.x-mol.com/groups/Zhao_Junfeng
参考文献：
1.Hu, L.; Xu, S.; Zhao, Z.; Yang, Y.; Peng, Z.; Yang, M.; Wang, C.; Zhao, J. J. Am. Chem. Soc. 2016, 138, 13135-13138.( https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.6b07230)
2.Yang, J.; Wang, C.; Xu, S.; Zhao, J. Angew. Chem. Int. Ed. 2019, 58, 1382-1386.( https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.201811586)
3.Yang, J.; Wang, C.; Yao, C.; Chen, C.; Hu, Y.; He, G.; Zhao, J. J. Org. Chem. 2020, 85, 1484-1494.( https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.joc.9b02486)
4.Yang, M.; Wang, X.; Zhao, J. ACS Catal. 2020, 10, 5230-5235.( https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.0c00523)
5.Wang, X.; Yang, Y.; Zhao, Y.; Wang, S.; Hu, W.; Li, J.; Wang, Z.; Yang, F.; Zhao, J. J. Org. Chem. 2020, 85, 6188-6194.( https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.joc.0c00485)
6.Yao, C.; Yang, J.; Lu, X.; Zhang, S.; Zhao, J. Org. Lett. 2020, 22, 6628-6631.( https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.orglett.0c02402)
7.Liu, T.; Xu, S.; Zhao, J. Chin. J. Org. Chem. 2021, 41, 873-887.（研究专题：炔酰胺缩合剂研究进展）(http://sioc-journal.cn/Jwk_yjhx/EN/abstract/abstract348237.shtml)
8.Wang, Z.; Wang, X.; Wang, P.; Zhao, J. J. Am. Chem. Soc. 2021, 143, 10374-10381.( https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c04614)
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