北京大学化学与分子工程学院雷晓光课题组、唐淳课题组与合作者-北京生命科学研究所董梦秋课题组在《Nature Communications》杂志上发表合作论文，题目为：“Characterization of protein unfolding by fast cross-linking mass spectrometry using di-ortho-phthalaldehyde cross-linkers”。该研究报导了一类最新开发出的、赖氨酸选择性的化学交联剂DOPA （di-ortho-phthalaldehyde cross-linkers）；并且证明DOPA交联剂具有不易水解、反应速度快、以及对低温、低pH和变性剂具有良好兼容性等特点；该化学交联剂被成功运用于捕获蛋白质变性去折叠的中间态和终态构象，以及追踪蛋白质构象变化等重要生命过程，从而推动了化学交联质谱技术的发展，提升了其在蛋白质结构与功能解析中的应用前景。

化学交联结合质谱技术 (chemical cross-linking coupled with mass spectrometry, CXMS) 是近年来迅猛发展的一种检测蛋白质结构和蛋白质相互作用的方法。随着质谱仪器以及交联数据搜索算法的发展，CXMS技术已经获得了长足的进步。除此之外，新型交联剂的开发也是推动该技术发展的重要方向之一。赖氨酸是一类含量丰富的氨基酸 (约7%)，CXMS技术中应用最为广泛的交联反应也是基于赖氨酸侧链氨基的反应。现阶段商业可得的赖氨酸交联剂大多包含琥珀酰亚胺酯或亚氨酸酯活性基团，如双琥珀酰亚胺辛二酸酯 (DSS)。虽然此两类活性酯获得了一定的应用，但其存在易水解而失效的缺陷。因此开发一类不水解、高选择性的赖氨酸交联剂具有重要意义。

基于此，为了进一步丰富交联剂的种类，研究人员发展了一系列基于邻苯二甲醛 (ortho-phthalaldehyde) 结构的赖氨酸选择性交联剂，命名为DOPA，DOPA交联剂可以有效地连接蛋白质表面两个赖氨酸残基，图1。尤其是DOPA2交联剂在蛋白混合物上展现出较高的交联反应效率，图2。

图1. DOPA交联剂与赖氨酸特异性发生交联反应

图2. DOPA交联剂在十个蛋白混合物中的交联表现

研究人员进一步探究DOPA交联剂性质时，发现DOPA交联剂展现出了不水解、反应速度快、耐低温、低pH和变性剂的特性，因此决定将其运用到蛋白质变性去折叠过程中结构动态变化研究。在金黃色葡萄球菌核酸酶（SNase），牛血清白蛋白（BSA）和牛胰腺核糖核酸酶A（RNaseA）变性去折叠过程中，DOPA2成功捕捉到了蛋白从折叠态到去折叠态的转换。如DOPA2捕获了牛胰腺核糖核酸酶A（RNaseA）在8M尿素中的连续变性过程，再结合分子动力学模拟，获得了RNaseA去折叠中间体的构象集合，图3。DOPA交联剂的这些特点成功拓展了CXMS技术的应用范围，使该技术研究蛋白质空间结构动态变化成为可能。

图3. DOPA2交联质谱技术分析RNaseA在8M尿素中的变性过程

雷晓光教授，董梦秋研究员和唐淳教授为该论文共同通讯作者。董梦秋课题组王建华博士和雷晓光课题组唐毓良博士为该文章共同第一作者。该工作还得到了中国科学院精密测量科学与技术创新研究院龚洲博士，马萨诸塞大学医学院Rohit Jain博士，原董梦秋课题组谭丹博士，中科院生物物理所叶克穷研究员，北京生命科学研究所黄牛研究员、周宇博士，雷晓光课题组肖凡、李强博士以及云南大学柳树群教授的支持。上述研究得到了科技部-国家重点研发计划-蛋白质机器与生命调控专项、国家自然科学基金委、北京分子科学国家研究中心、北大-清华生命科学联合中心、中科院和北京市卓越青年科学家计划等科研项目和研究机构的资助。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-28879-4

参考资料：https://www.chem.pku.edu.cn/kyjz/136639.htm