利用化学修饰手段对线性多肽进行结构约束是近年多肽药物化学领域的一个热门课题。 其中大环化是多肽修饰最有效的手段之一， 通过对线性肽上的多个侧链进行交联形成多环环肽也为具有新颖拓扑结构的生物活性分子构建提供新思路。目前制备多环肽的策略通常是将预制好的模板分子连接到线性肽的侧链上，这种“嫁接式”的多环化策略大多被具有高反应活性的半胱氨酸所“垄断”。因此需要发展新的具有高灵活度和广泛适用性的复杂多环肽合成策略（图1a）。

图 1. 化学选择性修饰构建多环环肽

2021年，陈弓课题组利用简单的甲醛分子(a)实现了对赖氨酸 (Lys，K)和酪氨酸 (Tys，Y)以及赖氨酸 (Lys，K)和精氨酸 (Arg，R)之间的交联反应，从而开发了一套简单实用的策略用于“装订”天然多肽（Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 6646-6652），分别命名为KaY和KaR反应。在KaR反应中，研究人员发现甲醛可与胍基和氨基选择性高效缩合生成四氢三嗪结构 (tetrahydrotriazine, THT)（图1b）。在此基础上，课题组对该多组分缩合反应进一步探究。

近日陈弓教授实验室升级并拓展了KaR反应，利用胺-甲醛-胍（am-a-gu，am代指胺，gu代指胍）三组分反应实现了一种具有广泛底物普适性和高灵活度的新型多环化方法。作者通过使用胍基试剂以及简单的甲醛水溶液，在温和的条件下便可以实现对未保护的多肽的“缝合”修饰，得到结构新颖的稠合四氢三嗪环结构（Fused-THT）的同时，还可以构建出复杂、新奇的多环肽结构（图2）。

图 2 胺-甲醛-胍三组分反应构建多环肽

在底物1中，作者在序列中引入了两个Lys和一个Arg，以HFIP为溶剂并加入甲醛，室温下5个小时即可高效地构建稠合的四氢三嗪环连接结构，并得到了一对具有区域异构的双环多肽（trace-2），并将这类多组分反应命名为K(2)-a-R反应，并且该反应同样也可以在碱性的PBS缓冲液中顺利进行（trace-4）。

普适性研究中，大多数极性的官能团均不会干扰该反应，如羧基(Glu)，羟基(Thr)，咪唑(His)，巯基(Cys)可以通过对序列的调整从而规避其对反应的干扰(9)。将N端甘氨基作为成环组分进行GK-a-R成环时产率较低（12），主要以单环产物（13）；而将N端换成更长的6-氨基己酸时产率得到明显提升（14）。作者还可以将K(2)-a-R反应成功应用到构建具有巢状拓扑结构的三环多肽（11）。

图 3 K(2)-a-R反应

接着作者又将K(2)-a-R反应中的固定在肽链上的胍基部分(Arg)移除，并引入了盐酸胍作为胍基组分，同样实现了多组分缩合反应并构建了一系列环肽分子，甲醛和胍将多肽上两个Lys交联起来构建环肽的反应，作者命名为K(2)-a-gu反应（gu代指胍）。

如图4所示，以含有两个Lys线性肽作为模板肽链，加入盐酸胍和甲醛，以TFE作为溶剂，室温反应5 h即可高效地得到单一区域异构体环肽产物16。同时该反应也可以在水和TFE的混合溶剂中进行，部分水溶性较好的底物可以在PBS缓冲溶液中顺利进行。该反应可以兼容几乎所有的氨基酸种类，并且两个Lys间距长短对反应的影响也不是很大。各种胍的衍生物如炔基胍、苄基胍（32）、丹磺酰胍（33）以及环胍（35）也能够高效率参与到K(2)-a-gu反应中。此外该反应也可以在固相上高效进行，避免了因液相反应中浓度过高产生的分子间交联副反应的同时，也为高通量合成这类环肽分子奠定了可能。

图 4 K(2)-a-gu反应

从环胍产物35中得到启发，作者又利用甲醛、盐酸胍对线性肽链上三个Lys进行关环，从而高效地得到三环稠合的三嗪环（tris-THT）结构并“缝合”出产物37。作者将甲醛和胍以及多肽上三个Lys交联起来构建双环肽的反应命名为K(3)-a-gu反应。

该反应同样可以兼容各种极性氨基酸（Glu、Asn、Thr等）。此外，同样利用内酰胺成环的环肽，再经过K(3)-a-gu反应从而得到具有类似鸟巢拓扑结构的产物48。最后作者通过一锅法，先采用K(2)-a-gu反应得到bis-THT结构的环肽后，再与另外一分子丁胺进行二次缩合得到杂合tris-THT结构的环肽49。

图 5 K(3)-a-gu反应

为展示此类反应的应用潜力，陈弓课题组同南开大学郭东升课题组进行合作，利用这类三组分反应所产生的bis-THT和Tris-THT亲水性“帽子”嫁接到杯芳烃下缘上（51和55），从而形成具有一定大小的空腔。利用1H NMR滴定法进行卤负离子 (F-, Cl-, Br-) 的络合实验发现，这种稠合的四氢三嗪环修饰得到的产物 (55) 室温下在氘代氯仿中能够选择性与F-结合 (3.64 × 103 M−1) ，而未形成Tris-THT结构的54则与F-有着较弱的结合能力 (Ka=1.60 × 102 M-1) 。

图 6

图 7

理论计算部分，中科院有机所的薛小松课题组通过密度泛函理论（DFT）对反应进程进行了揭示（图7）。首先以甲醛、甲胺、胍之间的反应模拟反应体系，对反应初始的两种可能启动路径进行了理论计算，结果表明， pathway II中启动步骤在动力学上更为有利。质子化的胍基57经历脱质子化后继续与甲醛反应生成胍的羟甲基化产物59，再质子化并脱水得到胍亚胺产物61，此时甲胺作为亲核试剂进攻胍亚胺并跨越18.7kcal/mol能垒生成第一步分子间交联产物，该途径能够释放足够的能量（ΔG= -13.1 kcal / mol），为完成整个反应提供了强大的驱动力。同时作者发现胍与胍、胺与胺的同质交联（homo-crosslinking）产物能量均高于异质交联产物，这为多氨基体系中优先选择性地发生异质交联提供了理论依据。

综上，陈弓教授课题通过对甲醛多组合交联化学的拓宽和优化，在之前工作的基础上发展了升级版的am-a-gu反应从而实现无保护多肽的“缝合”修饰，构建出了更加复杂、新颖且具有拓扑结构的多环肽分子，丰富了复杂多肽的化学空间，相关工作最近发表在Journal of the American Chemical Society上 （DOI：10.1021/jacs.2c04620）。