图1. 光笼5'帽类似物用于光控mRNA翻译示意图（图片来源：Nat. Chem.）

研究背景

信使RNA（简称mRNA）是一种参与蛋白质合成的单链RNA。mRNA的作用是将蛋白质信息从细胞核中的DNA传送到细胞质，随后读取mRNA序列并将每个三碱基密码子翻译成其相应的氨基酸。真核生物mRNA具有特定的 5'帽结构，其通过5'-5'三磷酸桥将N7-甲基化鸟苷连接到第一个转录核苷酸。5'帽结构在翻译起始中起关键作用，主要归因于 N7 甲基化鸟苷对于翻译起始因子eIF4E的特定识别。同时5'帽对于许多mRNA质控起关键作用，并保护真核mRNA免受外切酶降解。mRNA周转和体内平衡需要专用的去盖酶（Dcp1-2、DcpS）。5'帽与3'末端的poly(A)尾一起形成mRNA“闭环”，从而促进eIF4E和poly(A)结合蛋白之间的相互作用。没有5'帽的RNA几乎不翻译，并且具有高度免疫原性。因此，用于生物学研究和治疗应用的mRNA的生产通常涉及5'-加帽。

图2. 真核生物mRNA翻译启动过程以及化学修饰的位点（图片来源：Nat. Chem.）

关键合成步骤

作者通过在5'端鸟苷N²引入光裂解基团，其中氨基甲酸甲酯作为桥连物可在光作用下有效裂解。以鸟苷为起始反应物，首先使用三甲基甲硅烷基氯化物（Me₃SiCl）保护羟基。然后在一锅反应中，将鸟苷的游离氨基转化为异氰酸酯，通过与邻硝基苄基 （ONB） 醇、3,4-二甲氧基- 2-硝基苄基（DMNB）醇、6-硝基胡椒基（NP）醇、6-硝基胡椒基-甲基（NPM）醇反应，形成光可裂解基团或红移衍生物。之后用氨水（THF溶液）去除TMS基团以获得光笼鸟苷。然后将光笼鸟苷在5'-OH处单磷酸化以产生图二中6a,b化合物，甲基化后形成化合物7a,b，并与鸟苷-5'-二磷酸咪唑啉偶联从而得到最终产物。

图3. 具有光可裂解基团（FlashCaps）的帽类似物以及光触发翻译的整体合成思路（图片来源：Nat. Chem.）

结构及性能分析

作者进一步分析了N²位置具有光可裂解基团鸟苷的吸收光谱。ONB鸟苷仅在300 nm以上显示低吸光度，DMNB鸟苷在350 nm处显示最大吸收，NP和NPM鸟苷略微红移，在360 nm处达到最大值。为了选择最适合生物应用的光可裂解基团，作者在中性pH的水溶液中照射并分析它们的减少以及天然鸟苷的形成的HPLC和LC-MS谱图。结果表明，在365 nm处，短时间照射（5-15 s）足以去除10 μL 500 μM 溶液中的光裂解基团，释放游离鸟苷。在 405 nm，NP、NPM和DMNB组在60 s后被有效去除，比ONB组更有效。在420 nm，NPM组在120 s后完全去除。因此，作者最终选择了DMNB和NPM组进行进一步研究，并合成了各自的cap0类似物。生成的FlashCaps在N²位置包含DMNB或NPM基团。它们在300 nm以上的吸收光谱和它们的解笼罩动力学类似于各自的光笼鸟苷。其还还通过在细胞裂解物中孵育cap 0或FlashCaps，然后进行HPLC分析来评估氨基甲酸酯键的生物稳定性。FlashCaps在30小时内表现出高稳定性，表明氨基甲酸酯键不是裂解液降解的主要点。

图4.  光可裂解基团 (FlashCaps)基本表征（图片来源：Nat. Chem.）

随后，作者评估了光可裂解基团如何影响5'帽与eIF4E的相互作用。在光笼帽存在的情况下，使用微量热泳（MST）对FlashCaps和Cy5标记的eIF4E的结合测量发现没有产生结合曲线。在相同条件下，光诱导去除光笼基后，则获得了与帽0相似范围内的特征结合曲线和Kd值（0.3 μM），表明帽0有效形成。作者同时还研究了光可裂解基团如何影响与帽修饰酶的相互作用。DcpS是一种焦磷酸酶，可在真核细胞中将帽结构水解为m7GMP和GDP。结果表明，与eIF4E的结果相似，DcpS——一种结合但非切割的脱帽酶变体——与cap0相互作用，但不与FlashCaps相互作用。

图5. 光可裂解基团 (FlashCaps)修饰的mRNA基本表征（图片来源：Nat. Chem.）

总结

随着新冠的大爆发，信使RNA（mRNA）新冠疫苗再次成为研究热点，其中以Moderna和BioNTech/Pfizer为代表，它们编码刺突蛋白可有效防止SARS-CoV-2感染。mRNA技术不仅限于疫苗接种，还可改善自身免疫性疾病以及实现个性化的癌症治疗。然而，到目前为止，还没有策略可以有效实现定时、定点mRNA表达，即在不改变mRNA性能的前提下控制特定组织的递送和摄取。在本文中，研究人员开发了一种通过光控制mRNA翻译的技术——FlashCaps。FlashCaps作为mRNA5'帽类似物，通过裂解氨基甲酸酯键连接的单个光笼基基团，导致快速有效地释放天然结构。FlashCap-mRNAs具有以下优势：（1）仅包含一个光可切割基团；（2）无光照时可暂停蛋白质翻译；（3）定时、定点释放天然 cap 0（无帽结构）-mRNA；（4）不改变mRNA自身序列；（5）不具有免疫原性。

图6.  Andrea Rentmeister 教授（图片来源：Muenster university）

Andrea Rentmeister教授在格拉茨大学和波恩大学获得化学工程和化学专业博士学位，之后加入加州理工学院弗朗西斯·阿诺德实验室（2018年诺贝尔奖获得者）进行博士后研究。2010年成为汉堡大学生物化学初级教授。目前，她在明斯特大学担任生物分子标记化学教授。致力于了解mRNA翻译机制并最终控制其特定转录及翻译。开发多种化学和化学酶促方法，对mRNA进行分子水平上操作、分析以及控制，并将其应用于活细胞以及体内。

图7. Andrea代表奥地利参加2000年夏季奥运会参赛照片（图片来源：Imago）

文章详情：

Klöcker, N., Weissenboeck, F.P., van Dülmen, M. et al. Photocaged 5′ cap analogues for optical control of mRNA translation in cells. Nat. Chem. (2022). https://doi.org/10.1038/s41557-022-00972-7

课题组网页：https://www.uni-muenster.de/Cells-in-Motion/people/all/rentmeister-a.php

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