传统的SPPS所采用的固定相（聚苯乙烯基质交联1-2%二乙烯苯）因其在水溶液中极低的溶胀而不能直接使用于ASPPS。与此不同，ChemMatrix （100% 聚乙二醇）树脂符合这一技术要求。聚乙二醇具有双亲性质，使其在诸如水、四氢呋喃、甲醇、二氯甲烷和二甲基甲酰胺等多种溶剂中展现出较好的溶胀效果。另外一种可以用于ASPPS的树脂为PEGA树脂。与纯聚乙二醇为骨架的ChemMatrix树脂不同，PEGA树脂的骨架为聚乙二醇与聚丙烯酰胺嵌段共聚物。在溶胀方面，PEGA与ChemMatrix表现相当。除此之外，聚乙二醇与氨甲基聚苯乙烯侧链共聚产生的接枝共聚物（PEG-PS）和TentaGel树脂（聚乙二醇与低交联羟乙基聚苯乙烯）也可以作为ASPPS的固定相。ASPPS树脂的功能性手臂与传统的SPPS并无太大差异，比如Rink amide, HMPB (hydroxymethyl-3-methoxyphenoxy-butyric acid)和HMBA (hydroxymethyl-benzoic acid)等。

使用于ASPPS的缩合试剂必须满足：1） 在水溶液中具有相当的溶解度；2）在水溶液中具有相当的稳定性；3）羧基活化后的稳定性；4）羧基活化，以及酰胺键形成的较快反应速率；5）低消旋副反应等条件。符合以上要求并且经常在ASPPS中广泛应用的缩合试剂，最常用的为EDC-HCl（也被称做WSCD），已在多篇文献中报道。EDC经常与HONB，Oxyma, sulfo-HOSu等缩合添加物联用。可应用在ASPPS中的其它缩合试剂还包括DMTMM, TNTU, COMU （图1）。

图1. 常用ASPPS缩合试剂与添加剂 （图片来源：Green Chem.）

有研究发现，HATU和PyBOP在水溶液中的缩合反应表现劣于COMU。后者与2,6-二甲基哌啶联用，在降低氨基酸消旋副反应上有良好表现，并在ASPPS法合成低极性多肽方面实现了应用。TCFH (N,N,N’,N’-tetramethylchloroformamidinium hexafluorophosphate) 与三甲基哌啶介导的，在20 % PolarClean®（methyl 5-(dimethylamino)-2-methyl-5-oxopentanoate）水溶液中，以TentaGel S作为树脂的ASPPS的表现比COMU 更优秀 （图2）。TNTU作为缩合试剂的作用在一项ASPPS对比实验中不如EDC，即便在HONB的存在下也表现不佳，其主因在于TNTU的水解。与此不同的是，DMTMM可以胜任50% 的乙醇水溶液中的缩合反应，但在纯水中的缩合效率低下。

图2. TCFH和PolarClean化学结构

实际上, N^α-Fmoc保护的氨基酸在很多绿色溶剂中的低溶解度限制了这些绿色溶剂的使用。对于水来说，这个问题更加突出。Fmoc-Xaa-OH在水中通常具备非常低的溶解度，极大阻碍了ASPPS。针对氨基酸溶解度的问题，一些新型N^α-保护基团应运而生，并在ASPPS中验证了其价值。这些保护基包括Pms (2-[phenyl(methyl)sulfonio]ethyloxycarbonyl tetrafluoroborate, 2-[苯基(甲基)磺酰基]乙氧羰基四氟硼酸盐), Esc (ethanesulfonylethoxycarbonyl, 乙磺酰基乙氧基羰基), Sps (2-(4-sulfophenylsulfonyl)ethoxycarbonyl, 2-(4-磺基苯磺酰基)乙氧羰基)，它们的化学结构如图3A所示。不难发现，这些Fmoc的替代物在化学结构上与Fmoc存在明显相似点，即2-X-乙氧羰基，其中X为强拉电子基团。与Fmoc一样，这些N^α-保护基都可以与碱发生E1cB消除反应，以及随之而来的脱羧反应，实现N^α的脱保护（图3B）。这些ASPPS的N^α-保护基团，其X部分都含有亲水结构，而不同于Fmoc里高度疏水的芴Fluorenyl 。这个特征可以显著增加N^α-保护氨基酸在水中的溶解度，从而满足ASPPS对于氨基酸水溶液的浓度要求。这些新型的N^α-保护基氨基酸实现了Metenkephalin和Leu-enkephalin的水基固相合成。研究人员在这些项目中使用了PEG-PS树脂，EDC, DMTMM或者TNTU 缩合试剂，以及HONB和sulfo-HOSu缩合添加剂。Pms-Xaa-OH 被EDC/HONB缩合，而Esc-或Sps-Xaa-OH的缩合反应是在DIPEA的存在下进行的。在所有这些ASPPS中，固相洗涤溶液为纯水或0.2%的Triton X（曲拉通100）水溶液，后者可以增加树脂的溶胀度。尽管这些新型N^α-保护基在ASPPS中得到了一定程度的应用，但也存在与之俱来的缺陷，比如Pms的稳定性问题，以及Esc在水溶液中脱保护不彻底的现象。

图3. N^α-保护基团 Fmoc类似物，以及碱性环境脱保护反应。（图片来源：Green Chem.）

一种Fmoc的类似物，被称作Smoc（2,7-disulfo-9-fluorenylmethoxycarbonyl，2,7-二磺基-9-芴基甲氧羰基）的N^α-保护基也在ASPPS中得到了使用。Smoc是Fmoc上2,7-位的2个H被磺酸基取代后衍生得到的（图4），因为磺酸基的存在，其碱敏感性和水溶液溶解度都得到了增强。其脱保护的方式与机理也与Fmoc相同。

图4. Smoc保护基团

在一系列Smoc-Xaa-OH参与的ASPPS反应中，酰基载体蛋白 (ACP) 65–74 , oxytocin, 和vasopressin等多肽的合成得到了令人满意的收率（大约72%）。研究者使用EDC作为缩合试剂，在测试的各种缩合添加剂中，oxyma的表现最佳，其次为HOPO。使用了HMPB-ChemMatrix和H-Rink amide-ChemMatrix树脂。所有固相洗涤均通过水实现。Smoc的脱保护由1 M NaOH 水溶液（Rink amide-ChemMatrix树脂）或5-10% 哌嗪水溶液完成。

尽管传统的Fmoc 和Boc-氨基酸在水中的低溶解度阻碍了它们在ASPPS中的使用，但研究者还是尝试了这些传统SPPS原料在ASPPS方案中的利用可能。他们使用氧化锆珠将这些氨基酸粉末研磨成纳米颗粒，得到了 250-500 纳米范围的Fmoc-氨基酸纳米颗粒和500-750 纳米范围的Boc-氨基酸，并将这些研磨后的纳米颗粒的水悬浮液投入固定相进行ASPPS合成（图5）。通过这种手段，研究者以Fmoc-ASPPS方式在TentaGel树脂上合成了一个五肽。固相洗涤液为纯水，Fmoc脱保护试剂为0.1 M NaOH的90% 乙醇水溶液，缩合试剂组为EDC/HONB/DIPEA，最终得到了61%的五肽收率。在另一项相关实验中，研究者使用Boc-氨基酸实现了89%收率的Leu-Enkephalin 的ASPPS合成。缩合试剂为DMTMM/NMM, 并使用含有少量TFA的4 M HCl溶液脱Boc。该实验者还发现，这种纳米颗粒技术可以结合微波ASPPS完成长肽的合成。他们采取DMTMM/NMM缩合试剂，并且发现该合成方法可以明显降低氨基酸消旋副反应。例如Cys(Acm)的消旋从传统有机溶剂介导的SPPS的10.5%降低到了0.5%；而His(Trt)的消旋率从13.8%减少到了3.3%。

图5. Fmoc/Boc-氨基酸纳米颗粒水悬浮液介导的ASPPS （图片来源：Green Chem.）。

另外一组研究者通过2% (w/w) TPGS-750-M–H₂O胶束介质实现了Z-氨基酸短肽（二至三肽）ASPPS合成, 其示意图见图6。

图6. TPGS-750-M–H₂O水性胶束中的多肽合成（图片来源：Green Chem.）

尽管三官能团氨基酸的侧链在传统SPPS中通常是被保护的，但这些氨基酸中除了Cys的巯基，Lys的氨基和Asp/Glu的羧基之外，其余官能团可以在不被保护的情况下参与多肽合成，比如Ser/Thr的羟基，His的咪唑基，Tyr的酚羟基，Asn/Gln的酰胺基，Trp的吲哚基和Arg的胍基。这些非极性保护基团的去除，可以增加主体氨基酸自身的亲水性，并提高它们在水溶液中的溶解度，无论从增加原子经济性，降低PMI，还是实现绿色ASPPS的角度来看，摆脱不必要氨基酸侧链保护基都是有益的。有研究者成功使用侧链不保护的Pms-Tyr-OH和Esc-Tyr-OH作为原料合成了Met-Enkephalin和Leu-Enkephlin。

本文作者在最后总结了文献报道的ASPPS实例（表1）。

表1. 文献报道ASPPS实例总览（图片来源：Green Chem.）

在绿色化学方兴未艾的当今，传统的固相多肽合成面临过度使用有害有机溶剂的瓶颈，也因此受到环境与监管部门的挑战。在这种大环境下，开发多肽合成的绿色溶剂成为整个行业的关注点。本文重点介绍了水作为溶剂介导多肽固相合成的技术，从树脂、缩合试剂、N-保护基，以及侧链保护基的角度，讨论了该技术和工艺的可应用性，并列举了水基多肽固相合成的成功案例。

尽管相较于绿色有机溶剂引发的多肽生产变革，水基固相多肽合成的工业应用有待增强，但它代表了绿色多肽合成的一种发展方向。在树脂基质，缩合试剂，N^α-保护基的共同进化下，ASPPS有望取得更大的应用价值。

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