在可见光区进行光转化的荧光染料在生物成像领域中发挥着重要作用。虽然高效的光转换荧光蛋白已经得到应用，但是如何发展小尺寸、高性能和实用性强的光转换荧光探针仍是值得关注的问题。利用双色光转化荧光团（DCPFs）在转化前后发光颜色及强度的变化，研究者可以用来追踪标记物的动态变化。目前，DCPFs的设计原则包括罗丹明染料的脱烷基化、花菁类染料的光截断、AIE分子的光脱氢环化、噁嗪的螺吡化和光氧化脱氢等。尽管DCPFs的发展已经取得了很大的进步，但是仍存在着光转换效率低、发光强度弱以及需要光毒性的紫外光激发等缺陷。

本文中，作者建立了构筑DCPFs的新策略，即基于定向光氧化诱导转换（DPIC）机理。作者认为荧光团在经历部分定向光漂白后，激发和发射光谱会发射移动。

荧光团在光照后产生单线态氧发生光漂白，导致不可逆的光化学裂解生成不发光产物。作者设想在荧光团上修饰芳香性单线态氧活性基团（ASORM）后可以1）增加体系的共轭导致光谱红移；2）单线态氧定向氧化ASORM后，导致共轭结构被破坏，从而引起激发和发射光谱的移动（Figure 1）。

Figure 1. 定向光氧化诱导转化（DPIC）原理及光照后分子的化学结构（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

研究中，作者选择香豆素作为小尺寸、高亮度蓝光发射的荧光团。香豆素染料具有高摩尔消光系数、明亮发射和低细胞毒性的特点，非常适合作为荧光成像探针。小尺寸的吡咯和呋喃基团能够在单线态氧作用下发生光氧化导致脱芳构化，因此被选作为ASORM。香豆素骨架与N-甲基吡咯和呋喃通过Witing反应偶联分别得到共轭程度提高的苯乙烯基-香豆素类衍生物SC-P和SC-F（Figure 1）。为了证明在光转换过程中ASORM的独特作用，作者还合成了苯乙烯基-香豆素噻吩（SC-T）和苯乙烯基-香豆素茴香醚（SC-A）作为对照。

Figure 2. SCs的光谱研究和光照实验（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

作者对合成的苯乙烯基-香豆素类衍生物（SCs）进行了光学性质表征。SCs在不同溶剂中都表现为高亮度发射和大摩尔消光系数，并伴随着轻微的溶剂化效应。在甲醇溶剂中，SC-T、SC-F和SC-A的吸收和发射峰位置相近，分别在425和512 nm处（Figure 2A），荧光量子产率能够达到0.77，SC-P表现出明显的光谱红移现象。为了表征化合物的双色光转换特性，作者用488 nm激光激发染料的甲醇溶液并记录下不同时间点下的发射光谱（Figure 2B）。实验结果表明，与SC-A和SC-T表现的缓慢光漂白现象相比，含有ASORM的SC-F和SC-P则表现出在光照后明显的蓝移现象，分别移动了24 nm和68 nm，发射波长也分别蓝移至486 nm和483 nm（Figure 2C-D）。为了更好地表征光转换产物（cSC），作者对光照前后的化合物进行了液质色谱分析（Figure 2E）。数据显示SC-P和SC-F会转换为氧化形式的异构体，由于ASORMs的脱芳构化会使其吸收光谱出现蓝移。同时，由于光转换产物cSC-P 、cSC-F和SC-V的激发和发射光谱的相似性，可以推断出光转换的机制来源于香豆素和ASROM之间共轭程度的破坏（Figure 2F）。

Figure 3. 定向光氧化诱导转化的内在机制（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

如Figure 3所示，SC-P在被可见光照射后达到激发态，再传能至三线态氧³O₂，³O₂通过系间穿越过程和三线态弛豫过程产生单线态氧¹O₂）。在单线态氧的存在下，SC-P经历了光转换过程。以上实验证明了DPIC机制导致了荧光探针的双发射光转换性质。

Figure 4. SC-P标记的Hela细胞的共聚焦成像图片（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

为了证明基于DPIC机制的荧光探针的实用性，作者将具有最快光转换速率和波长变化最大的化合物SC-P作为研究对象，并将其对Hela细胞进行染色标记（Figure 4）。从Fgiure 4A-B中可以看出，在488 nm激发光照射下，光转化过程发生并伴随着SC-P强度的减弱和cSC-P强度的增加。同时，作者将SC-P与商用染料SMCy 5.5进行共染，可以看出SC-P的亲脂性和电中性使其可以特异性地靶向脂滴，共定位系数能够达到83%（Figure 4C）。此外，光转换后的产物cSC-P也依然能够保持对脂滴良好的靶向性（Figure 4D）。最后，作者又证明了SC-P和cSC-P能够对脂滴进行时空动态示踪，可以媲美于商用染料SMCy 5.5的成像效果（Figure 4E-F）。