导读

近日，哈佛医学院Brian J. Bacskai和Hak Soo Choi教授团队在利用近红外荧光寿命技术穿透小鼠完整头骨实现对淀粉样β-蛋白聚集物和tau原纤维的成像方面取得新进展，相关研究成果以“Near-infrared fluorescence lifetime imaging of amyloid-β aggregates and tau fibrils through the intact skull of mice”为题发表在Nature Biomedical Engineering（影响因子：29.234）上。本文报道了近红外离子型七次甲基荧光染料ZW800-1C在与淀粉样β-蛋白聚集物和tau原纤维结合后表现出高对比度，并实现了穿过小鼠完整头骨的显微成像。在阿尔茨海默病的转基因小鼠模型中，作者将ZW800-1C与两种光谱性质类似的荧光团ZW800-1A和吲哚菁绿（ICG）的性能进行比较，数据表明ZW800-1C染料在与蛋白聚集物和原纤维结合后展现出了更明显的荧光寿命差异，有望应用于对啮齿动物中淀粉样β-蛋白聚集物和tau原纤维的检测。文章链接DOI: 10.1038/s41551-023-01003-7。

正文

阿尔茨海默病(AD)是一种致命的神经退行性疾病，该疾病的主要神经病理学特征是由淀粉样β-蛋白和神经原纤维缠结（NFTs）聚集而形成的细胞外病变老年斑。目前，AD病理成像的最常见手段是磁共振成像（MRI），正电子发射断层扫描（PET），单光子发射计算机断层扫描 (SPECT)和光学成像技术。其中，光学成像技术具有高灵敏度、相对安全、成本低和操作性强的特点。相对于可见光窗口而言，血液和皮肤组织对近红外窗口（700-1000 nm）的激发和发射光的吸收与散射作用较小。因此，使用发光波长靠近近红外波段的材料能够有效减少背景荧光的干扰，增加组织的穿透深度，提高成像分辨率。但是目前近红外发射的AD探针却鲜有报道。下载化学加APP到你手机桌面，更方便更多收获。

本文中，作者将近红外七次甲基荧光染料ZW800-1C用于体内AD成像。数据表明该染料具有穿透模型小鼠血脑屏障（BBB）的能力。作者还将其与性质相似的染料ZW800-1A和吲哚菁绿（ICG）进行了性能对比。长波激发/长波发射的近红外染料ZW800-1C可以穿透小鼠的完整头骨对淀粉样斑块、脑淀粉样血管病变（CAA）和NFTs进行无创成像。此外，该染料还展现出可作为荧光寿命探针检测AD的潜力。如Fig.1a所示，ZW800-1A具有中心为氧原子的“柔性”连接基团。ZW800-1C中相对疏水的C-C键使其具有更好的双亲性。作者还将其与近红外染ZW800-1A和ICG进行了光谱对比（Fig.1b），均处于近红外发射区。

Fig. 1 七甲川染料用于AD成像（图片来源：Nat. Biomed. Eng.）

作者还利用宽场显微镜对三种染料分别染色的APP/PS1 和 rTg4510模型小鼠的脑组织切片进行了成像（Fig.2）。图像表明ZW800-1C、ICG与ThioS（AD的商用靶向探针）的共定位系数较高，而ZW800-1A对APP/PS1型小鼠中的淀粉样β-蛋白聚集物则没有明显的特异性识别。在rTg4510模型小鼠中，ZW800-1C与ICG对NFTs的共定位效果较好。对比之下，ZW800-1A和ICG只表现了单一的背景信号。

Fig. 2 APP/PS1和rTg4510型小鼠脑切片中淀粉样斑块的体外图像（图片来源：Nat. Biomed. Eng.）

为了同时进行可见光和近红外区体内成像，作者搭建了多模式显微镜并考察了三种染料对APP/PS1模型小鼠的BBB穿透能力以及对淀粉样斑块和CAA的标记能力（Fig.3a）。在对小鼠进行成像前1h，作者对其注射了甲氧基-X04（MX04）以标记淀粉样斑块和CAA。接下来，作者利用双光子显微镜考察在770 nm的激发光下ZW800-1C、ICG和ZW800-1A对CAA（Fig.3b）和斑块（Fig.3c）的标记效果。为了定量估计探针的标记强度，作者还计算了荧光团对斑块和CAA的平均强度（Fig.3d）以及大脑（Fig.3e）和尾静脉间歇采血测得的血液中近红外荧光团的动力学代谢过程。图Fig.3f表明在注射12 h后，三种染料的代谢率相似，强度均下降至最大值的20%。

Fig. 3 ICG、ZW800-1A和ZW800-1C染料对APP/PS1型小鼠的体内成像（图片来源：Nat. Biomed. Eng.）

作者又展开了三种染料对活体中NFT标记成像能力的考察（Fig.4a）。为了确认探针对NFT是否靶向，小鼠体内被提前注射了商用绿光染料HS-84。通过将三种染料与HS-84的共定位效果进行对比发现，ZW800-1C与HS-84的共定位效果较好，说明该染料能有NFT进行特异性结合（Fig.4d）。对比之下，ICG和ZW800-1A无法对细胞进行标记（Fig.4b, c）。此外，ZW800-1C在与NFTs结合后标记强度在前12 h内迅速下降，注射后24小时强度可以忽略不计（Fig.4e）。

Fig.4 ICG、ZW800-1A和ZW800-1C染料对rTg4510型小鼠的体内成像（图片来源：Nat. Biomed. Eng.）

作者利用荧光寿命成像显微镜（FLIM）技术探究ZW800-1C在与AD样品结合后是否伴随着荧光寿命的变化。将ZW800-1C分别注入C57BL/6J, APP/PS1和 rTg4510型小鼠体内，得到的荧光寿命图像如图Fig.5a-e所示。在C57BL/6J型小鼠中，ZW800-1C在血管中测得的平均寿命为测量值为0.84 ns（Fig.5a）。在APP/PS1型小鼠中观察到ZW800-1C在与CAA结合后，荧光寿命相对于血管中有所增加（Fig.5b）。在注射后2 h，染料与CAA（Fig.5c）和斑块（Fig.5d）结合后的荧光寿命均相比于在血管中的要更长。同时，在rTg4510型小鼠中也可以观察到ZW800-1C与NFT结合后寿命增加，平均寿命为1.14 ns （Fig.5e）。Fig.5f则给出了探针在血管中，β-淀粉样蛋白和tau聚集物中的平均荧光衰减寿命。通过比较ZW800-1C在血管内的寿命分布、与β-淀粉样蛋白和tau聚集物结合后的寿命，发现三组样本存在明显差别（Fig.5g）。因此，利用ZW800-1C在血管中、与AD样品结合后荧光寿命的差异可进行标记成像。

Fig.5 ZW800-1C染料对C57BL/6J, APP/PS1和 rTg4510 micerTg4510型小鼠的体内成像（图片来源：Nat. Biomed. Eng.）

最后，为了提高深层组织的成像分辨率，作者进行了双光子成像实验的探索。作者测试得到ZW800-1C的最大峰值吸收在1300 nm（Fig.6a）。借助双光子显微镜观察到ZW800-1C可以穿透小鼠的血脑屏障（Fig.6b），探针在小鼠脑中被代谢的速率较慢（Fig.6c）。为了进一步表征ZW800-1C的体内成像能力，作者对比了探针在体内和体外实验的成像信噪比（Fig.6d,e），同时证明该探针可以能够穿透完整颅骨进行AD样品的无损成像（Fig.6f-h），并能达到对单个NFT的高分辨率标记（Fig.6i）。此外，与通过颅窗的测量相比（Fig.6j），探针在穿过完整颅骨成像时的平均荧光寿命变短（对于淀粉样斑块，颅窗为1.24 ns，完整颅骨为1.05 ns；对于NFTs，颅窗为1.14 ns，完整颅骨为0.85 ns)。

Fig.6 ZW800-1C染料对AD样品的双光子和无损荧光寿命成像（图片来源：Nat. Biomed. Eng.）

总结

哈佛医学院Brian J. Bacskai和Hak Soo Choi教授团队报道了一种AD探针ZW800-1C。该探针在753 nm的激发光下可发射出772 nm的长波发射，因而被用于对β-蛋白聚集物和tau原纤维的近红外成像。相比于ZW800-1A和ICG染料，该探针在对AD模型小鼠的体内成像中取得了更好的检测效果。此外，作者利用FLIM技术发现ZW800-1C染料在与蛋白聚集物和原纤维结合后展现出了更明显的荧光寿命差异，对于区分AD病理和非特异性背景信号的意义重大。

文献详情：

Steven S. Hou, Joyce Yang, Jeong Heon Lee, Yeseo Kwon, Maria Calvo-Rodriguez, Kai Bao, Sung Ahn, Satoshi Kashiwagi, Anand T. N. Kumar, Brian J. Bacskai*, Hak Soo Choi*. Near-infrared fluorescence lifetime imaging of amyloid-β aggregates and tau fibrils through the intact skull of mice.

2023, https://doi.org/10.1038/s41551-023-01003-7