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JACS：功能DNA调节的CRISPR-Cas12a感应器用于非核酸目标的即时诊断

来源：化学加（ID：tryingchem）      2019-12-23
导读：除了其非凡的基因组编辑能力外，CRISPR-Cas系统还以其高碱基分辨率和等温信号放大开启了生物传感应用的新时代。然而，目前报道的CRISPR-Cas传感器大多只用于核酸的检测，对非核酸目标的应用有限。近日，南京大学张晶晶教授课题组、美国伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校陆艺教授课题组和南昌大学熊勇华教授课题组合作在J. Am. Chem. Soc.上报道了功能DNA分子调节的CRISPR-Cas12a感应器用于非核酸目标的即时诊断的新研究成果（DOI：10.1021/jacs.9b09211）。

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图片来源：J. Am. Chem. Soc.

最近发现和发展的规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR）和CRISPR关联蛋白（Cas）统称为CRISPR-Cas系统，不仅改变了基因组编辑，也改变了包括医学诊断在内的其他领域。例如，基于SHERLOCK (Specific High-sensitivity enzymatic Reporter UnLOCKing, 特异性高灵敏度酶促解锁)和DETECTR (DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter, DNA内切酶靶向的CRISPR反式报告检测系统) 的核酸传感器。在这类传感器中CRISPR- cas12a (Cpf1)是一类与单链导向的CRISPR RNA (crRNA)结合的2型V-A CRISPR相关酶。据报道，CRISPR- cas12a不仅可以像许多其他CRISPR- cas系统那样对目标DNA进行剪切，而且可以不加选择地对目标DNA附近的任何非目标ssDNA进行剪切。这种非目标ssDNA被附带剪切可以显著提高DNA检测的灵敏度。几乎所有报道的CRISPR-Cas传感器都是用来检测核酸相关目标的。因此，在可激活的CRISPR传感器的设计中仍然需要更多的策略，这些策略可以应用于核酸之外更广泛的目标。
为了充分发挥CRISPR技术在诊断应用中的潜力，作者基于靶向响应的功能DNAs(fDNAs)设计出可激活的CRISPR-Cas感应器。之所以选择fDNA，是因为它们被证明可以选择性地结合多种非核酸靶标，包括有机小分子、金属离子、蛋白质、病毒，甚至细胞，并且能从大型DNA文库中进行体外选择来获得。通过将fDNA与CRISPR-Cas12a结合，作者证明了这个系统可以使用核酸配体激活的CRISPR-Cas12a来检测和量化小的有机分子，用脱氧核酶激活的CRISPR-Cas12a来检测金属离子。
fDNA调节的CRISPR-Cas感应器由探针系统和报告系统两部分组成。探针系统包含fDNA和CRISPR-Cas12a的DNA启动子，报告系统包含crRNA预组装的Cas12a效应分子和被荧光团和淬灭剂标记的单链DNA (ssDNA)荧光报告基因(ssDNA-FQ)。在非核酸靶标缺失的情况下，fDNA以高于环境温度的解链温度与DNA启动子结合，阻止其与Cas12a-crRNA复合物结合(Locked Activator)。因此，Cas12a的侧裂活性无法被激活，使得ssDNA- FQ报告基因保持完整。完整的ssDNA- FQ上淬灭剂靠近荧光团，从而导致ssDNA荧光报告基因的荧光增加可以忽略。另一方面，在非核酸靶标存在的情况下，与fDNA结合的靶标可以使fDNA/DNA启动子的解链温度降低到环境温度以下，因此，DNA启动子可以与fDNA杂交，成为“Open Activator”，与Cas12a结合并激活Cas12a。在这种情况下，ssDNA报告基因可以被裂解，导致荧光团与淬灭剂分离，从而产生明显的荧光信号。
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 图片来源：J. Am. Chem. Soc.
为了论证上述fDNA调控的CRISPR-Cas12a感应器用于检测非核酸目标，作者首先选择了应用最广泛、研究最深入的腺苷5 -三磷酸腺苷(ATP)结构转换适配体作为检测目标。为了使基于CRISPR的ATP感应器具有良好的分析性能，作者设计了特定的ATP配体。该ATP配体能够与启动子杂交，有效阻断启动子与crRNA的结合，还能够以结构转换的方式有效地释放启动子以响应ATP目标。在ATP不存在的情况下，DNA启动子被ATP适配体杂交所锁定，不能结合crRNA激活Cas12a-crRNA的侧链裂解活性。在ATP存在的情况下，ATP适配体与ATP结合导致ATP适配体构象改变，这弱化了ATP适配体与DNA启动子杂交的能力。这使得DNA启动子可以在开放状态下释放，从而触发Cas12a-crRNA的侧裂活动。随后作者用电泳和荧光证实了适配体调控Cas12a-crRNA的激活。
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 图片来源：J. Am. Chem. Soc.
为了确定适配体调控的CRISPR-Cas12a感应器能否定量检测ATP，作者首先测量了不同浓度ATP在HEPES缓冲液中的荧光光谱。结果表明，荧光信号随着ATP浓度（0.39 μM~50 μM）的增加而增强。接着，作者对适配体调节的CRISPR-Cas12a感应器的选择性进行了研究。作者使用不同的竞争核苷酸-三磷酸类似物，如 GTP、CTP和UTP，进行了荧光分析。结果显示类似物组没有明显荧光增强，而ATP组荧光增强了10倍。这表明，ATP适配体的高选择性在适配体调控的CRISPR-Cas12a感应器中得到保留。随后，作者利用人的血浆验证了适配体调节的CRISPR-Cas12a感应器在实际样品中的应用可行性，并与商业试剂对比验证感应器的准确性和可靠性。结果显示CRISPR-Cas12a感应器可以克服人体血浆中其它成分的干扰，可以准确，可靠的即时检测非核酸目标。
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 图片来源：J. Am. Chem. Soc.
受到上述用适配体调控的CRISPR-Cas12a感应器检测ATP成功的鼓舞，作者使用商用便携式荧光仪在人血浆样本中进行了类似的测试。结果表明，在不同浓度的DNA启动子的作用下，传感器的荧光增强速度较快。此外，利用便携式荧光仪的快速荧光动力学测量，酶解所需时间进一步缩短到5分钟。
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 图片来源：J. Am. Chem. Soc.
最后，为了证明fDNA调控的CRISPR-Cas12a感应器的通用性，作者将该方法从适配体扩展到DNA酶来检测金属离子，如Na +。为了检测Na +，作者设计了Na +特异性DNA酶的模板链（NaA43S′）。NaA43S′的5′端修饰有DNA启动子序列，其3′被生物素标记。这样NaA43S′可以通过解链温度比室温高的18碱基对与酶链(NaA43E′)杂交。在缺乏Na +的情况下，模板链表现出最小的荧光信号，因为DNA启动子被DNA酶锁定。在Na +存在的情况下，NaA43S′被NaA43E′切成两半，DNA启动子被释放。释放的启动子与Cas12a-crRNA复合物进一步结合，激活Cas12a的侧裂活性，导致荧光信号的出现。结果表明，CRISPR-Cas12a感应器可以精确检测金属离子。
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 图片来源：J. Am. Chem. Soc.
总结：南京大学张晶晶教授课题组、美国伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校陆艺教授课题组和南昌大学熊勇华教授课题组合作展示了一个通用的功能DNA调节的CRISPR-Cas感应器用于定量检测两个非核酸目标。该设计策略可以将这个强大的CRISPR-Cas感应器系统扩展到其他目标。

撰稿人：犟子柳


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