图1.哌嗪衍生的LNP的合成与表征（图片来源：Nat. Commun.）

肝脏作为人体最大的代谢器官兼具储存糖原及造血功能，其中肝血窦（相邻肝板之间的腔隙，是一种特殊的毛细血管）包含不连续的脉管系统以及缓慢的血流，有利于肝细胞与血流之间进行物质交换，增加了纳米颗粒外渗和与肝细胞的相互作用，因此将RNA递送至非肝细胞成为亟待解决的问题。目前研究人员侧重于以下几个方面：1）对动物进行预处理，使肝细胞提前过载，从而改变LNP嗜性。然而，目前尚不清楚这种多步骤策略是否具有临床相关性；2）LNP偶联活性靶向配体。例如，DLin-MC3-DMA（一种经FDA批准用于肝细胞siRNA递送的可电离lipid）结合抗体可重新靶向免疫细胞。这种方法的潜在限制是——含有RNA药物的主动靶向纳米颗粒在临床试验中可引起不良事件。3）单个识别纳米颗粒体内代谢途径，实现内源性靶向。此方法需要高通量体内筛选，不适用于大型lipid库。因此目前大部分lipid高通量筛选处于在体外细胞水平。本文中，作者通过DNA序列“条形码”，筛选了65种不同的LNP，每个LNP均用独特的“条形码”标记。体内注射后，对从不同组织中提取的条码进行测序，通过检索14种细胞类型的DNA“条形码”，便可知其体内分布。

作者首先设计了由哌嗪核心和两个叔胺组成的可电离脂质体头部，其可与疏水碳链相连（Pi-Lipids）（图1a）。其中以哌嗪为核心，添加了从C10到C12的饱和烃链（之前研究表明C10到C12的烷烃长度有助于增强细胞膜穿透；ID:10-12）。此外，亚油酸链也被证实可增强LNP的胞内递送，因此作者也将其纳入体系（ID:18-2Z）（图 1b，c）。这八种新的基于哌嗪的可电离脂质体具体合成步骤如下：1,4-双（3-氨基丙基）哌嗪与Boc保护的β-丙氨酸或γ-氨基丁酸通过酰胺偶联反应12小时，产生哌嗪中间体，产率为50%。随后脱除Boc保护基，然后与不同疏水醛进行一锅法还原胺化反应，得到最终的哌嗪基脂质（PPZ），产率为32%至59%。作者改变了碳链键的长度并在两个骨架中合成了lipid，PPZ-A含两个碳，PPZ-B含三个碳。脂质结构通过核磁共振和高分辨率质谱分析确证。

图2. 量化分析65种mRNA LNP体内递送以及结构分析（图片来源：Nat. Commun.）

作者进一步研究了Pi-Lipids是否可制备为单分散LNP（Pi-LNP）。采用了（i）可电离阳离子lipid；（ii）两种具有不同碳链长度的PEG-lipid（C₁₄PEG_2K和C₁₈PEG_2K）；（iii）两种胆固醇（胆固醇、20α-羟基胆固醇）；（iv）磷酸乙醇胺（DOPE）。作者将Cre mRNA和DNA“条形码”以10比1的质量比进行混合。每个LNP都经过配制以携带其独特的DNA“条形码”，所有DNA“条形码”均为91nt长的单链DNA序列。用硫代磷酸酯修饰5'和3'末端以减少外切核酸酶降解，采用通用正向和反向引物区域以确保每个序列的相等扩增，包含7个随机核苷酸以监测PCR偏差。

在对65个Pi-LNP进行表征后，作者将其静脉注射入Ai14小鼠中（图 2a)。Ai14小鼠在CAG启动子下游有一个Lox-Stop-Lox-tdTomato构建体。因此，如果Cre mRNA被递送到靶细胞中并随后翻译成Cre蛋白，则细胞变为tdTomato+（图 2a）。通过荧光激活细胞分选分离tdTomato+细胞并对细胞进行测序，在tdTomato+细胞内分离与特定LNP相关的DNA 条形码。作者共量化了14个不同细胞群的tdTomato+细胞的百分比（图 2b）。在枯否细胞中观察到40%的tdTomato+细胞，在脾巨噬细胞中为10%，在脾树突细胞中为16%。在肝内皮细胞和树突细胞tdTomato+%<5%，肺和肾没有观察到tdTomato+细胞。之后，作者使用下一代DNA测序研究了65个LNP。然后，使用大型数据集对所有细胞类型进行全面结构分析。首先，分析了基于不同Pi-Lipid结构的LNP的平均归一化递送，发现含有PPZ-A10的Pi-LNP 表现出最高的递送，其次是PPZA11（图 2d）。作者假设在Pi-LNP之间观察到的标准化传递的差异可能是由于封装效率或LNP直径差造成的。为了验证这一假设，配制了八个LNP，仅改变可电离脂质结构，同时保持相同的摩尔比和化合物组成，并测量每个LNP的直径和封装效率（图 2e）。作者观察到分别用PPZ-A10到PPZ-A18-2Z配制的Pi-LNPs的封装效率从66%增加到88%，这表明封装效率随着碳链越长而增加。然而，具有较长碳链的Pi-LNP也显示出150到300 nm大直径，不利于LNP的体内递送。用PPZ-A和PPZ-B脂质配制的Pi-LNP之间的封装效率相当，但含有PPZ-B脂质的Pi-LNP 比PPZ-A的尺寸大，因此体内递送量降低（图 2d）。

本文中，作者通过设计、合成和表征128种新型Pi-LNP，并将核酸递送到体内的非肝细胞。其中LNP-A10，以低至0.3mg/kg的剂量优先向肝脏和脾脏免疫细胞递送mRNA。作者将PPZ脂质的结构与包含哌嗪基序的商业脂质（C12-20039）进行比较，其添加了酰胺键并去除了羟基。羟基会产生立体异构体，使纯化变得困难。相比之下，PPZ脂质是手性纯的，这使得它们更容易纯化。作者发现与之前报道的C12-20039相比，Pi-LNP对脾巨噬细胞和树突状细胞的递送增加。

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