萜类化合物是数量庞大的一类天然产物，结构复杂多样、生物活性丰富，是天然产物药物研发的重要来源，目前有许多萜类药物应用于临床，例如倍半萜青蒿素、二萜紫杉醇、三萜雷公藤内酯等。其中天然二倍半萜目前仅报道了1300余个，其结构骨架复杂、生物活性良好，值得深入研究和开发。如何高效挖掘新颖骨架二倍半萜类化合物，是这个领域亟待解决的问题。真菌来源的二倍半萜合酶通常含有催化异戊二烯链延伸和环化两个结构域，被统称为双功能萜合酶（BFTPS）（图1A）。目前仅报道了57个真菌双功能二倍半萜合酶，催化形成了19种不同的结构骨架类型（图1B），其催化产物结构骨架的多样性源于双功能萜合酶环化结构域的精密调控，因此，通过改造双功能萜合酶环化结构域，拓展双功能萜合酶的催化功能及其催化产物结构，这对新颖骨架结构二倍半萜类化合物及其生物学功能的研究与开发，具有重要的意义。 
为了高效挖掘双功能萜合酶的催化功能及其产物结构多样性，该团队选择真菌BFTPS作为研究对象，通过蛋白质工程改造策略，在萜类骨架的环化反应机制研究方面取得了一定的基础（Org. Lett. 2021, 23, 4645−4650；Chem. Commun. 2022, 58, 9476–9479；Synth. Syst. Biotechnol. 2024, 380−387）（图1C）。进一步聚焦催化Type B型二倍半萜的BFTPS，寻找调控碳正离子中间体发生特定的环化级联反应的关键功能位点，通过改造关键功能位点，挖掘BFTPS的催化新功能。 该研究工作选取Type B型双功能萜合酶PfNS作为目标蛋白，其产物为Type B型的5/11二环二倍半萜nigtetraene（1）。基于Type B型的二环nigtetraene（1）和三环ophiobolin F（2）的环化路径（图2A），并结合MD模拟分析PfNS和AcOS的环化结构域催化口袋氨基酸的动态构象变化，发现两者的差异氨基酸主要位于蛋白质结构中的D-helix和G2-helix部位。D-helix上的差异氨基酸与空间相邻的芳香族氨基酸形成簇，这些芳香族氨基酸簇可通过多种相互作用稳定碳正离子中间体。此外，差异位点W193和T194位于G2-helix上，而G1/2-helix在不同的萜合酶中被证明可稳定碳正离子中间体。
图2 （A）PfNS和AcOS催化产物的环化路径推导；（B）MD模拟分析PfNS和AcOS与IM1复合物的构象变化。 通过分析PfNS和AcOS与IM1的复合物轨迹（图2B），推测推测关键氨基酸差异导致口袋形状不同，从而影响催化产物。要将PfNS改造成AcOS，需重新排列其氨基酸布局。为了验证假设，该作者先对PfNS进行了以下实验：1）对这5个氨基酸位点进行丙氨酸扫描，结果显示单点突变体失活，产物消失，证实这5个位点对PfNS酶催化功能的重要性；2）逐个替换AcOS的差异氨基酸，单点突变体仍失活；3）通过分析AcOS与IM1复合物的MD轨迹中G2-helix上氨基酸位点与中间体的相互作用，进行双点突变，结果双突变体PfNS-W193L/T194W产生Type A型二倍半萜3–7；4）将双突变体中的Y113突变为F，得到三突变体，其催化相同产物3–7，且产量是双突变体的2.8倍；5）在三突变体上将F89突变为A，得到四突变体，其活性口袋体积增大，产生了少量三环产物ophiobolin F（2），结果与推测相符（图3）。为了验证PfNS口袋的氨基酸重排规律，该作者将AcOS的差异位点突变为PfNS对应位点。结果双突变体和三突变体均失活。对AcOS的F66进行突变后，单点突变体F66L活性降低，生成少量二环产物8，验证了PfNS和AcOS口袋的氨基酸重排规律，实现PfNS和AcOS催化二环和三环骨架结构的互换（图3）。 
图3 PfNS, AcOS及其突变体的催化产物鉴定。有趣的是，通过重塑PfNS环化结构域活性口袋中芳香族氨基酸簇，双突变体PfNS-W193L/T194W催化形成5个Type A型二倍半萜产物，包括3个新的5/15二环产物（fictetraenes A–C）和2个14元大环产物（新产物 (15S,1E,2E)-cericerene和已报道的植物来源的 (2E)-cericerene）。进一步组合的三突变体PfNS-Y113F/W193L/T194W表现出催化活性提升， Type A型二倍半萜的产量是双突变体PfNS-W193L/T194W的2.8倍。通过MD模拟分析，发现底物GFPP在PfNS-Y113F/W193L/T194W的活性空腔中更有利于Type A型的折叠构象。口袋内的芳香族氨基酸和碳正离子中间体通过cation−π作用稳定关键的碳正离子中间体，并通过C−H∙∙∙π作用降低反应的活化能，有利于生成Type A型14元大环二倍半萜产物（图3）。 综上所述，该研究工作基于分子动力学MD模拟辅助的双功能萜合酶PfNS和AcOS蛋白质工程改造，成功实现了Type B型5/11二环和5/8/5三环骨架产物的互换，揭示了PfNS中芳香族氨基酸簇对于萜合酶Type B和Type A型催化功能转换的精密调控（图4）。这项研究深化了我们对于二倍半萜合酶在催化底物环化过程中的认识，为拓展萜合酶催化功能及其产物空间提供了一个切实可行的全新策略。
图4 重新编排ARC调控PfNS和AcOS催化功能转化刘雪婷教授和王馨叶博士为该论文的共同通讯作者，博士研究生张维燕为该论文的第一作者。该研究工作得到了张立新教授的长期指导和大力支持、加拿大圭尔夫大学（University of Guelph）Tom Hsiang教授的多年合作和指导、中山大学巫瑞波教授和日本北海道大学（Hokkaido University）Hideaki Oikawa教授的指导，华东理工大学药学院朱彬博士在单晶测试和分析方面提供了帮助。该研究工作得到了国家自然科学基金（21977029, 81903529, 31720103901, 22307037），国家重点研发计划（2020YFA090032 和 2022YFC2105400），中国博士后科学基金项目（2019M661403），111引智计划（B18022），上海市科学技术委员会（21NL2600100），以及生物反应器工程国家重点实验室开放项目等项目基金的支持。 张立新团队聚焦“天然药物的高效发现与量产”研究主线，2024年取得了一系列原创性新发现（2024年6月5日在Nat. Biotechnol.长文在线发表血红素及卟啉化合物的高效生物制造；Nat. Prod. Rep. 2024；Trends Biotechnol. 2024；Angew. Chem. 2024）。刘雪婷课题组以“微生物天然药物的高效发现”为研究主线，多年来致力于利用合成生物学策略合成“非天然”的活性天然产物及生物合成关键酶的催化机制研究，以通讯或共通讯作者发表于Angew Chem，JACS Au，Nat Prod Rep，Org Lett，Cell Chem Biol，Chem Commun 等学术论文50余篇，授权专利11件（转让1件）。欢迎感兴趣的青年学子加入我们（liuxueting@ecust.edu.cn）。
Function Switch of a Fungal Sesterterpene Synthase through Molecular Dynamics Simulation Assisted Alteration of an Aromatic Residue Cluster in the Active Pocket of PfNS.Weiyan Zhang, Xinye Wang, Guoliang Zhu, Bin Zhu, Kaitong Peng, Tom Hsiang, Lixin Zhang, Xueting Liu.Angew. Chem. Int. Ed. 2024, e202406246.
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